Validazione di un marcatore diagnostico e prognostico nella progressione dello scompenso cardiaco

Dopo un intenso lavoro e diverse pubblicazioni sulla proteina del surfattante di tipo B (SP-B), il gruppo dell’IRCCS Centro Cardiologico Monzino ha recentemente esposto i risultati di un nuovo studio coordinato dal Prof. Piergiuseppe Agostoni, responsabile dell’area di cardiologica critica e dalla Dr.ssa Cristina Banfi responsabile del Laboratorio di Proteomica Funzionale del Centro Cardiologico Monzino IRCCS, condotto nell’ambito del progetto “Strategie integrate per lo studio dei determinanti delle malattie cardiovascolari e per l’identificazione di biomarcatori delle stesse”, promosso dalla Rete Cardiologica Italiana.  

La ricerca precedente aveva dimostrato che SP-B, o la forma immatura proSP-B, possiede caratteristiche strutturali e funzionali per essere considerata un buon marcatore diagnostico: elevato grado di specificità tessutale, un peculiare processo biosintetico della proteina, è dotata di funzioni biologiche fondamentali, con caratteristiche chimico-fisiche che le conferiscono un ruolo potenziale causale degli eventi precoci CV. Alcuni dati, inoltre, indicano che la proteina può essere un indicatore precoce di danno della barriera polmonare, un marcatore prognostico dello scompenso e un marcatore dell’efficacia terapeutica (si veda la bibliografia).

La nuova indagine ha arruolato 471 pazienti con scompenso cardiaco e 164 soggetti controllo, reclutati dal Monzino in collaborazione con Fondazione Maugeri e Istituto Auxologico Italiano. Tutti i soggetti hanno eseguito esami ematochimici, test da sforzo cardiopolmonare massimale a rampa personalizzata, spirometria semplice, misurazione della DLCO nelle sue sottocomponenti e, nei pazienti patologici, il monitoraggio cardiorespiratorio notturno per la valutazione dei disturbi del sonno (in seguito oggetto di un ulteriore studio). 

“Un bell’esempio di ricerca biomedica accompagnata da un intenso lavoro di sviluppo metodologico e tecnologico: non esisteva un saggio che potesse permettere di apprezzare i livelli quantitativi di proSPB”, spiega Cristina Banfi del Centro Cardiologico Monzino IRCCS, tra gli Autori del lavoro. “Abbiamo sviluppato ad hoc un metodo basato sulla spettrometria di massa (MRM) che prevede diversi step. Il primo consiste nell’arricchire il plasma con la frazione HDL dal momento che avevamo dimostrato che SP-B si lega in maniera selettiva alle HDL. Successivamente i campioni sono stati separati mediante cromotografia, ionizzati mediante electrospray per consentire l’analisi di spettrometria di massa con modalità triple quadrupole. In questo modo arrivano al detector solo ioni relativi all’analita di interesse, poi quantificati in maniera specifica. Il metodo sviluppato ha permesso di monitorare simultaneamente, nello stesso campione, le varie proteoforme di SP-B: sia nella forma immatura, con significato diagnostico, prognostico e di marcatore terapeutico, sia nella forma matura che viene rilasciata nel surfattante polmonare. Attraverso l’analisi quantitativa specifica si è confermato il dato semi-quantitativo ottenuto negli studi precedenti dimostrando che nei pazienti con scompenso cardiaco (HF) i peptidi proteotipici che riconoscono la forma immatura di SP-B sono molto più elevati rispetto ai controlli. Mentre la forma matura di SP-B non varia”. 

A ulteriore completamento è stata introdotta una nuova tecnologia per eseguire un’analisi di proteomica a target: lo scopo è di identificare altri marcatori HF che, in un modello statistico da sviluppare, possono essere integrati per supportare il valore diagnostico e prognostico di SP-B. La tecnologia, denominata “Proximity extension assay-based proteomics”, permette di analizzare migliaia di proteine in soli due microlitri di plasma. L’analita, in questo caso proteine, viene riconosciuto simultaneamente da due anticorpi ingegnerizzati che ne riconoscono due porzioni diverse. Nel caso in cui l’analita venga riconosciuto dagli anticorpi, due oligonucleotidi si accoppiano e il risultato può essere amplificato mediante una reazione PCR. E’ una tecnologia estremamente sensibile, specifica.

“Sono stati così identificati 18 proteine/marcatori, alcuni dei quali non noti in precedenza come marcatori di scompenso, che variano nei pazienti con HF. Andremo a sviluppare modelli statistici per validare modelli integrati. Le proteine in oggetto hanno un ruolo molto variegato, dalla risposta immunitaria, all’infiammazione, alla degradazione della matrice extracellulare”, osserva Banfi. 

L’analisi infine è stata estesa a un sottogruppo di pazienti con scompenso cardiaco e apnee del sonno, comuni nei soggetti HF e che contribuiscono a peggiorare la prognosi. Ciò avviene attraverso meccanismi come un’ipossia intermittente che può causare aumento dello stress ossidativo, aumento dell’infiammazione, un’attivazione simpatica e una disfunzione endoteliale. “Ma non esistono marcatori che permettano di identificare i soggetti a rischio. Applicando il nostro approccio di proteomica abbiamo identificato 40 proteine che sono in grado di discriminare tra i pazienti con o senza apnee notturne. L’identificazione di questi marcatori potrebbe migliorare la diagnosi precoce, la stratificazione del rischio e il monitoraggio dei pazienti HF con apnee del sonno”, conclude la ricercatrice.